Incorporation of fluorescent proteins into biochemical systems has revolutionized the field of bioimaging. In a bottom-up approach, understanding the photophysics of fluorescent proteins requires detailed investigations of the light-absorbing chromophore, which can be achieved by studying the chromophore in isolation. This paper reports a photodissociation action spectroscopy study on the deprotonated anion of the red Kaede fluorescent protein chromophore, demonstrating that at least three isomers–assigned to deprotomers–are generated in the gas phase. Deprotomer-selected action spectra are recorded over the S1 ← S0 band using an instrument with differential mobility spectrometry coupled with photodissociation spectroscopy. The spectrum for the principal phenoxide deprotomer spans the 480–660 nm range with a maximum response at ≈610 nm. The imidazolate deprotomer has a blue-shifted action spectrum with a maximum response at ≈545 nm. The action spectra are consistent with excited state coupled-cluster calculations of excitation wavelengths for the deprotomers. A third gas-phase species with a distinct action spectrum is tentatively assigned to an imidazole tautomer of the principal phenoxide deprotomer. This study highlights the need for isomer-selective methods when studying the photophysics of biochromophores possessing several deprotonation sites.

1.
M.
Chalfie
,
Y.
Tu
,
G.
Euskirchen
,
W.
Ward
, and
D.
Prasher
,
Science
263
,
802
(
1994
).
2.
J.
Lippincott-Schwartz
,
Science
300
,
87
(
2003
).
3.
K. A.
Lukyanov
,
D. M.
Chudakov
,
S.
Lukyanov
, and
V. V.
Verkhusha
,
Nat. Rev. Mol. Cell Biol.
6
,
885
(
2005
).
4.
N. C.
Shaner
,
G. H.
Patterson
, and
M. W.
Davidson
,
J. Cell Sci.
120
,
4247
(
2007
).
5.
D. M.
Chudakov
,
M. V.
Matz
,
S.
Lukyanov
, and
K. A.
Lukyanov
,
Physiol. Rev.
90
,
1103
(
2010
).
6.
Fundamentals of Fluorescence Imaging
, edited by,
G.
Cox
(
Jenny Stanford Publishing
,
2019
).
7.
A. B.
Cubitt
,
R.
Heim
,
S. R.
Adams
,
A. E.
Boyd
,
L. A.
Gross
, and
R. Y.
Tsien
,
Trends Biochem. Sci.
20
,
448
(
1995
).
8.
J.
Zhang
,
R. E.
Campbell
,
A. Y.
Ting
, and
R. Y.
Tsien
,
Nat. Rev. Mol. Cell Biol.
3
,
906
(
2002
).
9.
M.
Zimmer
,
Chem. Rev.
102
,
759
(
2002
).
10.
S. R.
Meech
,
Chem. Soc. Rev.
38
,
2922
(
2009
).
11.
R. Y.
Tsien
,
Annu. Rev. Biochem.
67
,
509
(
1998
).
12.
R.
Heim
,
D. C.
Prasher
, and
R. Y.
Tsien
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
91
,
12501
(
1994
).
13.
M.
Ormö
,
A. B.
Cubitt
,
K.
Kallio
,
L. A.
Gross
,
R. Y.
Tsien
, and
S. J.
Remington
,
Science
273
,
1392
(
1996
).
14.
R.
Ando
,
H.
Hama
,
M.
Yamamoto-Hino
,
H.
Mizuno
, and
A.
Miyawaki
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
99
,
12651
(
2002
).
15.
H.
Mizuno
,
T. K.
Mal
,
K. I.
Tong
,
R.
Ando
,
T.
Furuta
,
M.
Ikura
, and
A.
Miyawaki
,
Mol. Cell
12
,
1051
(
2003
).
16.
M.
Tomura
,
N.
Yoshida
,
J.
Tanaka
,
S.
Karasawa
,
Y.
Miwa
,
A.
Miyawaki
, and
O.
Kanagawa
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
105
,
10871
(
2008
).
17.
V.
Adam
,
M.
Lelimousin
,
S.
Boehme
,
G.
Desfonds
,
K.
Nienhaus
,
M. J.
Field
,
J.
Wiedenmann
,
S.
McSweeney
,
G. U.
Nienhaus
, and
D.
Bourgeois
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
105
,
18343
(
2008
).
18.
Photophysics of Ionic Biochromophores
, edited by
S.
Brøndsted Nielsen
and
J. A.
Wyer
(
Springer
,
2013
).
19.
S. B.
Nielsen
,
A.
Lapierre
,
J. U.
Andersen
,
U. V.
Pedersen
,
S.
Tomita
, and
L. H.
Andersen
,
Phys. Rev. Lett.
87
,
228102
(
2001
).
20.
M. W.
Forbes
and
R. A.
Jockusch
,
J. Am. Chem. Soc.
131
,
17038
(
2009
).
21.
S. H. M.
Deng
,
X.-Y.
Kong
,
G.
Zhang
,
Y.
Yang
,
W.-J.
Zheng
,
Z.-R.
Sun
,
D.-Q.
Zhang
, and
X.-B.
Wang
,
J. Phys. Chem. Lett.
5
,
2155
(
2014
).
22.
A. V.
Bochenkova
,
B.
Klaerke
,
D. B.
Rahbek
,
J.
Rajput
,
Y.
Toker
, and
L. H.
Andersen
,
Angew. Chem., Int. Ed.
53
,
9797
(
2014
).
23.
W.
Zagorec-Marks
,
M. M.
Foreman
,
J. R. R.
Verlet
, and
J. M.
Weber
,
J. Phys. Chem. Lett.
10
,
7817
(
2019
).
24.
K.
Bhaskaran-Nair
,
M.
Valiev
,
S. H. M.
Deng
,
W. A.
Shelton
,
K.
Kowalski
, and
X.-B.
Wang
,
J. Chem. Phys.
143
,
224301
(
2015
).
25.
J.
Langeland
,
C.
Kjær
,
L. H.
Andersen
, and
S.
Brøndsted Nielsen
,
ChemPhysChem
19
,
1686
(
2018
).
26.
W.
Zagorec-Marks
,
M. M.
Foreman
,
J. R. R.
Verlet
, and
J. M.
Weber
,
J. Phys. Chem. Lett.
11
,
1940
(
2020
).
27.
E.
Carrascosa
,
J. N.
Bull
,
M. S.
Scholz
,
N. J. A.
Coughlan
,
S.
Olsen
,
U.
Wille
, and
E. J.
Bieske
,
J. Phys. Chem. Lett.
9
,
2647
(
2018
).
28.
C. R. S.
Mooney
,
D. A.
Horke
,
A. S.
Chatterley
,
A.
Simperler
,
H. H.
Fielding
, and
J. R. R.
Verlet
,
Chem. Sci.
4
,
921
(
2013
).
29.
C. W.
West
,
J. N.
Bull
,
A. S.
Hudson
,
S. L.
Cobb
, and
J. R. R.
Verlet
,
J. Phys. Chem. B
119
,
3982
(
2015
).
30.
A.
Svendsen
,
H. V.
Kiefer
,
H. B.
Pedersen
,
A. V.
Bochenkova
, and
L. H.
Andersen
,
J. Am. Chem. Soc.
139
,
8766
(
2017
).
31.
J.
Tay
,
M. A.
Parkes
,
K.
Addison
,
Y.
Chan
,
L.
Zhang
,
H. C.
Hailes
,
P. C.
Bulman Page
,
S. R.
Meech
,
L.
Blancafort
, and
H. H.
Fielding
,
J. Phys. Chem. Lett.
8
,
765
(
2017
).
32.
J.
Fenn
,
M.
Mann
,
C.
Meng
,
S.
Wong
, and
C.
Whitehouse
,
Science
246
,
64
(
1989
).
33.
D.
Schröder
,
M.
Buděšínský
, and
J.
Roithová
,
J. Am. Chem. Soc.
134
,
15897
(
2012
).
34.
H.
Xia
and
A. B.
Attygalle
,
Anal. Chem.
88
,
6035
(
2016
).
35.
J. N.
Bull
,
E.
Carrascosa
,
L.
Giacomozzi
,
E. J.
Bieske
, and
M. H.
Stockett
,
Phys. Chem. Chem. Phys.
20
,
19672
(
2018
).
36.
J. N.
Bull
,
G.
da Silva
,
M. S.
Scholz
,
E.
Carrascosa
, and
E. J.
Bieske
,
J. Phys. Chem. A
123
,
4419
(
2019
).
37.
J. N.
Bull
,
J. T.
Buntine
,
E.
Carrascosa
,
M. H.
Stockett
, and
E. J.
Bieske
,
Eur. Phys. J. D
75
,
67
(
2021
).
38.
J. N.
Bull
,
C. S.
Anstöter
, and
J. R. R.
Verlet
,
Nat. Commun.
10
,
5820
(
2019
).
39.
J. N.
Bull
,
C. S.
Anstöter
, and
J. R. R.
Verlet
,
J. Phys. Chem. A
124
,
2140
(
2020
).
40.
C.
Ieritano
,
J.
Featherstone
,
A.
Haack
,
M.
Guna
,
J. L.
Campbell
, and
W. S.
Hopkins
,
J. Am. Soc. Mass Spectrom.
31
,
582
(
2020
).
41.
J. L.
Campbell
,
M.
Zhu
, and
W. S.
Hopkins
,
J. Am. Soc. Mass Spectrom.
25
,
1583
(
2014
).
42.
C.
Liu
,
J. C. Y.
Le Blanc
,
J.
Shields
,
J. S.
Janiszewski
,
C.
Ieritano
,
G. F.
Ye
,
G. F.
Hawes
,
W. S.
Hopkins
, and
J. L.
Campbell
,
Analyst
140
,
6897
(
2015
).
43.
C.
Liu
,
J. C. Y.
Le Blanc
,
B. B.
Schneider
,
J.
Shields
,
J. J.
Federico
,
H.
Zhang
,
J. G.
Stroh
,
G. W.
Kauffman
,
D. W.
Kung
,
C.
Ieritano
,
E.
Shepherdson
,
M.
Verbuyst
,
L.
Melo
,
M.
Hasan
,
D.
Naser
,
J. S.
Janiszewski
,
W. S.
Hopkins
, and
J. L.
Campbell
,
ACS Cent. Sci.
3
,
101
(
2017
).
44.
N. J. A.
Coughlan
,
P. J. J.
Carr
,
S. C.
Walker
,
C.
Zhou
,
M.
Guna
,
J. L.
Campbell
, and
W. S.
Hopkins
,
J. Am. Soc. Mass Spectrom.
31
,
405
(
2020
).
45.
W. S.
Hopkins
,
Mol. Phys.
113
,
3151
(
2015
).
46.
J. L.
Campbell
,
A. M.-C.
Yang
,
L. R.
Melo
, and
W. S.
Hopkins
,
J. Am. Soc. Mass Spectrom.
27
,
1277
(
2016
).
47.
S. W. C.
Walker
,
A.
Mark
,
B.
Verbuyst
,
B.
Bogdanov
,
J. L.
Campbell
, and
W. S.
Hopkins
,
J. Phys. Chem. A
122
,
3858
(
2017
).
48.
F. A.
Londry
and
J. W.
Hager
,
J. Am. Soc. Mass Spectrom.
14
,
1130
(
2003
).
49.
K.
Støchkel
,
B. F.
Milne
, and
S. B.
Nielsen
,
J. Phys. Chem. A
115
,
2155
(
2011
).
50.
J. A.
Wyer
and
S.
Brøndsted Nielsen
,
Angew. Chem., Int. Ed.
51
,
10256
(
2012
).
51.
M. J.
Frisch
,
G. W.
Trucks
,
H. B.
Schlegel
,
G. E.
Scuseria
,
M. A.
Robb
,
J. R.
Cheeseman
,
G.
Scalmani
,
V.
Barone
,
B.
Mennucci
,
G. A.
Petersson
,
H.
Nakatsuji
,
M.
Caricato
,
X.
Li
,
H. P.
Hratchian
,
A. F.
Izmaylov
,
J.
Bloino
,
G.
Zheng
,
J. L.
Sonnenberg
,
M.
Hada
,
M.
Ehara
,
K.
Toyota
,
R.
Fukuda
,
J.
Hasegawa
,
M.
Ishida
,
T.
Nakajima
,
Y.
Honda
,
O.
Kitao
,
H.
Nakai
,
T.
Vreven
,
J. A.
Montgomery
, Jr.
,
J. E.
Peralta
,
F.
Ogliaro
,
M.
Bearpark
,
J. J.
Heyd
,
E.
Brothers
,
K. N.
Kudin
,
V. N.
Staroverov
,
R.
Kobayashi
,
J.
Normand
,
K.
Raghavachari
,
A.
Rendell
,
J. C.
Burant
,
S. S.
Iyengar
,
J.
Tomasi
,
M.
Cossi
,
N.
Rega
,
J. M.
Millam
,
M.
Klene
,
J. E.
Knox
,
J. B.
Cross
,
V.
Bakken
,
C.
Adamo
,
J.
Jaramillo
,
R.
Gomperts
,
R. E.
Stratmann
,
O.
Yazyev
,
A. J.
Austin
,
R.
Cammi
,
C.
Pomelli
,
J. W.
Ochterski
,
R. L.
Martin
,
K.
Morokuma
,
V. G.
Zakrzewski
,
G. A.
Voth
,
P.
Salvador
,
J. J.
Dannenberg
,
S.
Dapprich
,
A. D.
Daniels
,
Ö.
Farkas
,
J. B.
Foresman
,
J. V.
Ortiz
,
J.
Cioslowski
, and
D. J.
Fox
, Gaussian 16 Revision B.01,
Gaussian, Inc.
,
Wallingford, CT
,
2016
.
52.
F.
Neese
,
Wiley Interdiscip. Rev. Comput. Mol. Sci.
2
,
73
(
2012
).
53.
M.
Kállay
,
Z.
Rolik
,
J.
Csontos
,
P.
Nagy
,
G.
Samu
,
D.
Mester
,
I.
Ladjánszki
,
L.
Szegedy
,
B.
Ladóczki
,
K.
Petrov
,
M.
Farkas
, and
B.
Hégely
, “
MRCC, A quantum chemical program suite
,” www.mrcc.hu.
54.
M.
Head-Gordon
and
T.
Head-Gordon
,
Chem. Phys. Lett.
220
,
122
(
1994
).
55.
J.-D.
Chai
and
M.
Head-Gordon
,
Phys. Chem. Chem. Phys.
10
,
6615
(
2008
).
56.
T. H.
Dunning
, Jr.
,
J. Chem. Phys.
90
,
1007
(
1989
).
57.
C.
Hättig
and
F.
Weigend
,
J. Chem. Phys.
113
,
5154
(
2000
).
58.
A. K.
Dutta
,
M.
Saitow
,
B.
Demoulin
,
F.
Neese
, and
R.
Izsák
,
J. Chem. Phys.
150
,
164123
(
2019
).
59.
F.
Santoro
,
A.
Lami
,
R.
Improta
,
J.
Bloino
, and
V.
Barone
,
J. Chem. Phys.
128
,
224311
(
2008
).
60.
A. V.
Marenich
,
C. J.
Cramer
, and
D. G.
Truhlar
,
J. Phys. Chem. B
113
,
6378
(
2009
).
61.
T.
Yanai
,
D. P.
Tew
, and
N. C.
Handy
,
Chem. Phys. Lett.
393
,
51
(
2004
).
62.
J. N.
Bull
,
C. W.
West
,
C. S.
Anstöter
,
G.
da Silva
,
E. J.
Bieske
, and
J. R. R.
Verlet
,
Phys. Chem. Chem. Phys.
21
,
10567
(
2019
).

Supplementary Material

You do not currently have access to this content.