Mechanical unfolding of proteins consisting of repeat domains is an excellent tool to obtain large statistics. Force spectroscopy experiments using atomic force microscopy on proteins presenting multiple domains have revealed that unfolding forces depend on the number of folded domains (history) and have reported intermediate states and rare events. However, the common use of unspecific attachment approaches to pull the protein of interest holds important limitations to study unfolding history and may lead to discarding rare and multiple probing events due to the presence of unspecific adhesion and uncertainty on the pulling site. Site-specific methods that have recently emerged minimize this uncertainty and would be excellent tools to probe unfolding history and rare events. However, detailed characterization of these approaches is required to identify their advantages and limitations. Here, we characterize a site-specific binding approach based on the ultrastable complex dockerin/cohesin III revealing its advantages and limitations to assess the unfolding history and to investigate rare and multiple events during the unfolding of repeated domains. We show that this approach is more robust, reproducible, and provides larger statistics than conventional unspecific methods. We show that the method is optimal to reveal the history of unfolding from the very first domain and to detect rare events, while being more limited to assess intermediate states. Finally, we quantify the forces required to unfold two molecules pulled in parallel, difficult when using unspecific approaches. The proposed method represents a step forward toward more reproducible measurements to probe protein unfolding history and opens the door to systematic probing of rare and multiple molecule unfolding mechanisms.

1.
L.
Tskhovrebova
,
J.
Trinick
,
J. A.
Sleep
, and
R. M.
Simmons
,
Nature
387
(
6630
),
308
312
(
1997
).
2.
E. L.
Florin
,
V. T.
Moy
, and
H. E.
Gaub
,
Science
264
(
5157
),
415
417
(
1994
).
3.
V. T.
Moy
,
E. L.
Florin
, and
H. E.
Gaub
,
Science
266
(
5183
),
257
259
(
1994
).
4.
M.
Rief
,
M.
Gautel
,
F.
Oesterhelt
,
J. M.
Fernandez
, and
H. E.
Gaub
,
Science
276
(
5315
),
1109
1112
(
1997
).
5.
P. E.
Marszalek
,
H.
Lu
,
H.
Li
,
M.
Carrion-Vazquez
,
A. F.
Oberhauser
,
K.
Schulten
, and
J. M.
Fernandez
,
Nature
402
(
6757
),
100
103
(
1999
).
6.
P. M.
Williams
,
Anal. Chim. Acta
479
(
1
),
107
115
(
2003
).
8.
M.
Hinczewski
,
C.
Hyeon
, and
D.
Thirumalai
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
113
(
27
),
E3852
E3861
(
2016
).
9.
M.
Carrion-Vazquez
,
A. F.
Oberhauser
,
S. B.
Fowler
,
P. E.
Marszalek
,
S. E.
Broedel
,
J.
Clarke
, and
J. M.
Fernandez
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
96
(
7
),
3694
3699
(
1999
).
10.
F.
Rico
,
L.
Gonzalez
,
I.
Casuso
,
M.
Puig-Vidal
, and
S.
Scheuring
,
Science
342
(
6159
),
741
743
(
2013
).
11.
F.
Kong
,
Z.
Li
,
W. M.
Parks
,
D. W.
Dumbauld
,
A. J.
García
,
A. P.
Mould
,
M. J.
Humphries
, and
C.
Zhu
,
Mol. Cell
49
(
6
),
1060
1068
(
2013
).
12.
V. I.
Zarnitsyna
,
J.
Huang
,
F.
Zhang
,
Y.-H.
Chien
,
D.
Leckband
, and
C.
Zhu
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
104
(
46
),
18037
18042
(
2007
).
13.
B. T.
Marshall
,
K. K.
Sarangapani
,
J.
Lou
,
R. P.
McEver
, and
C.
Zhu
,
Biophys. J.
88
(
2
),
1458
1466
(
2005
).
14.
R. C.
Zinober
,
D. J.
Brockwell
,
G. S.
Beddard
,
A. W.
Blake
,
P. D.
Olmsted
,
S. E.
Radford
, and
D. A.
Smith
,
Protein Sci.
11
(
12
),
2759
2765
(
2002
).
15.
K. M.
Tych
,
M. L.
Hughes
,
J.
Bourke
,
Y.
Taniguchi
,
M.
Kawakami
,
D. J.
Brockwell
, and
L.
Dougan
,
Phys. Rev. E
91
(
1
),
012710
(
2015
).
16.
D. E.
Makarov
,
Biophys. J.
96
(
6
),
2160
2167
(
2009
).
17.
D. E.
Makarov
,
P. K.
Hansma
, and
H.
Metiu
,
J. Chem. Phys.
114
(
21
),
9663
9673
(
2001
).
18.
R. B.
Best
,
D. J.
Brockwell
,
J. L.
Toca-Herrera
,
A. W.
Blake
,
D. A.
Smith
,
S. E.
Radford
, and
J.
Clarke
,
Anal. Chim. Acta
479
(
1
),
87
105
(
2003
).
19.
D. J.
Brockwell
,
G. S.
Beddard
,
J.
Clarkson
,
R. C.
Zinober
,
A. W.
Blake
,
J.
Trinick
,
P. D.
Olmsted
,
D. A.
Smith
, and
S. E.
Radford
,
Biophys. J.
83
(
1
),
458
472
(
2002
).
20.
I.
Schwaiger
,
A.
Kardinal
,
M.
Schleicher
,
A. A.
Noegel
, and
M.
Rief
,
Nat. Struct. Mol. Biol.
11
(
1
),
81
85
(
2004
).
21.
A. F.
Oberhauser
,
P. E.
Marszalek
,
M.
Carrion-Vazquez
, and
J. M.
Fernandez
,
Nat. Struct. Mol. Biol.
6
(
11
),
1025
1028
(
1999
).
22.
P.
Hinterdorfer
,
W.
Baumgartner
,
H. J.
Gruber
,
K.
Schilcher
, and
H.
Schindler
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
93
(
8
),
3477
3481
(
1996
).
23.
X. H.
Zhang
,
E.
Wojcikiewicz
, and
V. T.
Moy
,
Biophys. J.
83
(
4
),
2270
2279
(
2002
).
24.
D. A.
Pippig
,
F.
Baumann
,
M.
Strackharn
,
D.
Aschenbrenner
, and
H. E.
Gaub
,
ACS Nano
8
(
7
),
6551
6555
(
2014
).
25.
I.
Popa
,
R.
Berkovich
,
J.
Alegre-Cebollada
,
C. L.
Badilla
,
J. A. s.
Rivas-Pardo
,
Y.
Taniguchi
,
M.
Kawakami
, and
J. M.
Fernandez
,
J. Am. Chem. Soc.
135
(
34
),
12762
12771
(
2013
).
26.
B.
Zakeri
,
J. O.
Fierer
,
E.
Celik
,
E. C.
Chittock
,
U.
Schwarz-Linek
,
V. T.
Moy
, and
M.
Howarth
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
109
(
12
),
E690
E697
(
2012
).
27.
M.
Otten
,
W.
Ott
,
M. A.
Jobst
,
L. F.
Milles
,
T.
Verdorfer
,
D. A.
Pippig
,
M. A.
Nash
, and
H. E.
Gaub
,
Nat. Methods
11
(
11
),
1127
1130
(
2014
).
28.
C.
Schoeler
,
K. H.
Malinowska
,
R. C.
Bernardi
,
L. F.
Milles
,
M. A.
Jobst
,
E.
Durner
,
W.
Ott
,
D. B.
Fried
,
E. A.
Bayer
,
K.
Schulten
,
H. E.
Gaub
, and
M. A.
Nash
,
Nat. Commun.
5
,
5635
(
2014
).
29.
E.
Durner
,
W.
Ott
,
M. A.
Nash
, and
H. E.
Gaub
,
ACS Omega
2
(
6
),
3064
3069
(
2017
).
30.
K. C.
Neuman
,
T.
Lionnet
, and
J. F.
Allemand
,
Annu. Rev. Mater. Res.
37
(
1
),
33
67
(
2007
).
31.
E.
Celik
and
V. T.
Moy
,
J. Mol. Recognit.
25
(
1
),
53
56
(
2011
).
32.
Y.
Taniguchi
and
M.
Kawakami
,
Langmuir
26
(
13
),
10433
10436
(
2010
).
33.
R.
Walder
,
M.-A.
LeBlanc
,
W. J.
Van Patten
,
D. T.
Edwards
,
J. A.
Greenberg
,
A.
Adhikari
,
S. R.
Okoniewski
,
R. M. A.
Sullan
,
D.
Rabuka
,
M. C.
Sousa
, and
T. T.
Perkins
,
J. Am. Chem. Soc.
139
(
29
),
9867
9875
(
2017
).
34.
S. W.
Stahl
,
M. A.
Nash
,
D. B.
Fried
,
M.
Slutzki
,
Y.
Barak
,
E. A.
Bayer
, and
H. E.
Gaub
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
109
(
50
),
20431
20436
(
2012
).
35.
J.
Yin
,
P. D.
Straight
,
S. M.
McLoughlin
,
Z.
Zhou
,
A. J.
Lin
,
D. E.
Golan
,
N. L.
Kelleher
,
R.
Kolter
, and
C. T.
Walsh
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
102
(
44
),
15815
15820
(
2005
).
36.
J. L.
Zimmermann
,
T.
Nicolaus
,
G.
Neuert
, and
K.
Blank
,
Nat. Protoc.
5
(
6
),
975
985
(
2010
).
37.
M. L.
Hughes
and
L.
Dougan
,
Rep. Prog. Phys.
79
(
7
),
076601
(
2016
).
38.
J.
Yin
,
A. J.
Lin
,
D. E.
Golan
, and
C. T.
Walsh
,
Nat. Protoc.
1
(
1
),
280
(
2006
).
39.
J. E.
Sader
,
J. A.
Sanelli
,
B. D.
Adamson
,
J. P.
Monty
,
X.
Wei
,
S. A.
Crawford
,
J. R.
Friend
,
I.
Marusic
,
P.
Mulvaney
, and
E. J.
Bieske
,
Rev. Sci. Instrum.
83
(
10
),
103705
(
2012
).
40.
J. E.
Sader
,
R.
Borgani
,
C. T.
Gibson
,
D. B.
Haviland
,
M. J.
Higgins
,
J. I.
Kilpatrick
,
J.
Lu
,
P.
Mulvaney
,
C. J.
Shearer
,
A. D.
Slattery
,
P.-A.
Thorén
,
J.
Tran
,
H.
Zhang
,
H.
Zhang
, and
T.
Zheng
,
Rev. Sci. Instrum.
87
(
9
),
093711
(
2016
).
41.
J. L.
Hutter
and
J.
Bechhoefer
,
Rev. Sci. Instrum.
64
(
7
),
1868
1873
(
1993
).
42.
H. J.
Butt
and
M.
Jaschke
,
Nanotechnology
6
,
1
7
(
1995
).
43.
M. J.
Higgins
,
R.
Proksch
,
J. E.
Sader
,
M.
Polcik
,
S.
Mc Endoo
,
J. P.
Cleveland
, and
S. P.
Jarvis
,
Rev. Sci. Instrum.
77
(
1
),
013701
(
2006
).
44.
H.
Schillers
,
C.
Rianna
,
J.
Schäpe
,
T.
Luque
,
H.
Doschke
,
M.
Wälte
,
J. J.
Uriarte
,
N.
Campillo
,
G. P. A.
Michanetzis
,
J.
Bobrowska
,
A.
Dumitru
,
E. T.
Herruzo
,
S.
Bovio
,
P.
Parot
,
M.
Galluzzi
,
A.
Podestà
,
L.
Puricelli
,
S.
Scheuring
,
Y.
Missirlis
,
R.
Garcia
,
M.
Odorico
,
J.-M.
Teulon
,
F.
Lafont
,
M.
Lekka
,
F.
Rico
,
A.
Rigato
,
J.-L.
Pellequer
,
H.
Oberleithner
,
D.
Navajas
, and
M.
Radmacher
,
Sci. Rep.
7
(
1
),
5117
(
2017
).
45.
M.
Rief
,
J. M.
Fernandez
, and
H. E.
Gaub
,
Phys. Rev. Lett.
81
(
21
),
4764
4767
(
1998
).
46.
T.
Verdorfer
,
R.
Bernardi
,
A.
Meinhold
,
W.
Ott
,
Z.
Luthey-Schulten
,
M. A.
Nash
, and
H. E.
Gaub
,
J. Am. Chem. Soc.
139
(
49
),
17841
(
2017
).
47.
H.
Li
,
W. A.
Linke
,
A. F.
Oberhauser
,
M.
Carrion-Vazquez
,
J. G.
Kerkvliet
,
H.
Lu
,
P. E.
Marszalek
, and
J. M.
Fernandez
,
Nature
418
(
6901
),
998
1002
(
2002
).
48.
B. I.
Costescu
,
S.
Sturm
, and
F.
Gräter
,
J. Struct. Biol.
97
(
1
),
43
(
2016
).
49.
Y.
Cao
,
R.
Kuske
, and
H.
Li
,
Biophys. J.
95
(
2
),
782
788
(
2008
).
50.
P. M.
Williams
,
S. B.
Fowler
,
R. B.
Best
,
J.
Luis Toca-Herrera
,
K. A.
Scott
,
A.
Steward
, and
J.
Clarke
,
Nature
422
(
6930
),
446
449
(
2003
).
51.
A. F.
Oberhauser
,
P. K.
Hansma
,
M.
Carrion-Vazquez
, and
J. M.
Fernandez
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
98
(
2
),
468
472
(
2001
).
52.
R. B.
Best
,
S. B.
Fowler
,
J. L.
Toca-Herrera
, and
J.
Clarke
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
99
(
19
),
12143
12148
(
2002
).
53.
P.
Hanggi
,
P.
Talkner
, and
M.
Borkovec
,
Rev. Mod. Phys.
62
(
2
),
251
341
(
1990
).
54.
T.-L.
Kuo
,
S.
Garcia-Manyes
,
J.
Li
,
I.
Barel
,
H.
Lu
,
B. J.
Berne
,
M.
Urbakh
,
J.
Klafter
, and
J. M.
Fernández
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
107
(
25
),
11336
11340
(
2010
).
55.
S.
Garcia-Manyes
,
Bruji
,
J.
cacute
,
C. L.
Badilla
, and
J. M.
Fernández
,
Biophys. J.
93
(
7
),
2436
2446
(
2007
).
56.
M. A.
Jobst
,
L. F.
Milles
,
C.
Schoeler
,
W.
Ott
,
D. B.
Fried
,
E. A.
Bayer
,
H. E.
Gaub
, and
M. A.
Nash
,
eLife
4
,
e10319
(
2015
).
57.
O.
Salama-Alber
,
M. K.
Jobby
,
S.
Chitayat
,
S. P.
Smith
,
B. A.
White
,
L. J.
Shimon
,
R.
Lamed
,
F.
Frolow
, and
E. A.
Bayer
,
J. Biol. Chem.
288
(
23
),
16827
16838
(
2013
).
58.
H.
Chen
,
G.
Yuan
,
R. S.
Winardhi
,
M.
Yao
,
I.
Popa
,
J. M.
Fernandez
, and
J.
Yan
,
J. Am. Chem. Soc.
137
(
10
),
3540
3546
(
2015
).
59.
T. A.
Sulchek
,
R. W.
Friddle
,
K.
Langry
,
E. Y.
Lau
,
H.
Albrecht
,
T. V.
Ratto
,
S. J.
DeNardo
,
M. E.
Colvin
, and
A.
Noy
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
102
(
46
),
16638
16643
(
2005
).
60.
T. V.
Ratto
,
R. E.
Rudd
,
K. C.
Langry
,
R. L.
Balhorn
, and
M. W.
McElfresh
,
Langmuir
22
(
4
),
1749
1757
(
2006
).
61.
C.
Rankl
,
F.
Kienberger
,
L.
Wildling
,
J.
Wruss
,
H. J.
Gruber
,
D.
Blaas
, and
P.
Hinterdorfer
,
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
105
(
46
),
17778
17783
(
2008
).
62.
S.
Guo
,
C.
Ray
,
A.
Kirkpatrick
,
N.
Lad
, and
B. B.
Akhremitchev
,
Biophys. J.
95
(
8
),
3964
3976
(
2008
).
63.
J.-M.
Teulon
,
Y.
Delcuze
,
M.
Odorico
,
S.-w. W.
Chen
,
P.
Parot
, and
J.-L.
Pellequer
,
J. Mol. Recognit.
24
(
3
),
490
502
(
2011
).
64.
C.
Chu
,
E.
Celik
,
F.
Rico
, and
V. T.
Moy
,
PLoS One
8
(
5
),
e64187
(
2013
).
65.
S.
Guo
,
N.
Li
,
N.
Lad
,
S.
Desai
, and
B. B.
Akhremitchev
,
J. Phys. Chem. C
114
(
19
),
8755
8765
(
2010
).
66.
W.
Linke
,
Histol. Histopathol.
15
(
3
),
799
812
(
2000
).
67.
E.
Evans
,
Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.
30
,
105
128
(
2001
).
68.
T.
Sulchek
,
R. W.
Friddle
, and
A.
Noy
,
Biophys. J.
90
(
12
),
4686
4691
(
2006
).
69.
P.
Herman
,
S.
El-Kirat-Chatel
,
A.
Beaussart
,
J. A.
Geoghegan
,
T. J.
Foster
, and
Y. F.
Dufrêne
,
Mol. Microbiol.
93
(
2
),
356
368
(
2014
).

Supplementary Material

You do not currently have access to this content.